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    蛋白樣品的制備與定量

    發(fā)布時(shí)間: 2021-09-14  點(diǎn)擊次數(shù): 2441次

    (1)提細(xì)胞蛋白 

    ① 消化或刮下細(xì)胞至 1.5 的 EP 管中,標(biāo)記,10000r 離心 2min,PBS 洗 3 遍

    ② 吸去 EP 管中 PBS,最好用濾紙吸干里面的水分,加適量 RIPA 裂解液(RIPA 裂解液:蛋白酶抑制劑=250:1),如果你想做信號通路指標(biāo)還得再加上磷酸酶抑制劑(磷酸酶抑制劑: RIPA 裂解液=1:1000) 

    ③ 冰上裂解 30min~1h,開 4°離心機(jī) 

    ④ 4°離心 11000r,20min 

    ⑤ 測蛋白濃度,取上清,加蛋白上清的四分之一體積 5x 上樣 loading buffer,煮沸,分裝(蛋白質(zhì)變性)


    (2)提組織蛋白 

    ① 研缽中倒入液氮,加入組織塊,研磨,加液氮,藥匙刮 

    ② 刮下后放入 1.5ml 的 EP 管,加適量裂解液,吹打 

    ③ 冰上放置 1h,期間,每隔 10~15min 吹打一次,開 4°離心機(jī) 

    ④ 4°離心 10000r,1h 

    ⑤ 測蛋白濃度,取上清,加 1/4 體積 5x loading buffer,煮沸,分裝


    (3)測蛋白濃度(BCA 法) 

    ① 八個(gè)標(biāo)準(zhǔn)孔,按說明書先加超純水,再加標(biāo)準(zhǔn)蛋白液 

    ② 目的孔,每孔加 18ul 超純水+2ul 目的蛋白 

    ③ 按說明書配 BCA 工作液,每孔加 200ul 

    ④ 37°放置半小時(shí)后測濃度


    (4)計(jì)算上樣量,設(shè)計(jì)上樣順序 

    上樣體積:上樣量/濃度 x 5/4

    上樣順序:無處理,對照,處理;體積最好不要相差太大


    經(jīng)驗(yàn)總結(jié): 

    如何提高蛋白濃度:首先當(dāng)然是多種點(diǎn)細(xì)胞啦,其次可以少加點(diǎn)裂解液,盡量裂解充分。如何處理蛋白濃度低的問題:實(shí)驗(yàn)過程中發(fā)現(xiàn)蛋白的濃度太低,如果上樣的話,體積太大,甚至電泳孔都裝不下,舉例:假設(shè)我需要上樣 40ul 才能達(dá)到 20ug,那么顯然按照常規(guī)的方法,10 孔的梳子只能加 25ul 左右,我們此時(shí)可以取 40ul 蛋白入 EP 管中,放置于 PCR 儀器,變性溫度濃縮蛋白體積,這樣不斷濃縮之后促使 EP 管中蛋白的水分降低,蛋白量依舊是 20ug。如何保證對照組和實(shí)驗(yàn)組蛋白濃度大概是一致的:種植細(xì)胞的時(shí)候盡量保持鋪下去的細(xì)胞數(shù)接近,收細(xì)胞之后觀察細(xì)胞的多少適當(dāng)加入幾倍體積的裂解液。 


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