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病原微生物提取的方法有哪些？
發(fā)布時(shí)間： 2021-10-25 點(diǎn)擊次數(shù)： 1766次數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)
據(jù) WHO 統(tǒng)計(jì)，全球感染性疾病導(dǎo)致的患者死亡占全部死因的 25%以上，在中國，感染性疾病占所有疾病的 50%以上，75%造血系統(tǒng)腫瘤患者和 50%實(shí)體腫瘤患者死于感染，膿毒癥（嚴(yán)重感染）患者病死率高達(dá) 50%。而在面對疑難重癥時(shí)，快速檢測病原微生物變得刻不容緩。 
病原微生物是指侵犯入人體引起感染的微生物，或稱病原體。病原微生物包括病毒、細(xì)菌、真菌、支原體、衣原體、立克次體、螺旋體、寄生蟲和朊毒體等。mNGS就是綜合分析來自患者樣本的病原微生物的基因物質(zhì)（DNA和RNA），實(shí)現(xiàn)病原種屬的快速鑒定和深入分析。mNGS檢測技術(shù)由于通量高、快速、成本適宜、準(zhǔn)確度高等特點(diǎn)，在感染性疾病領(lǐng)域應(yīng)用愈發(fā)火熱，同時(shí)也正在改變原有的檢測手段，大大提高了危急重癥和疑難感染的診斷水平。
mNGS檢測流程包括：臨床評估、樣本收集、保存和運(yùn)輸、核酸提取、文庫構(gòu)建、上機(jī)測序、數(shù)據(jù)分析和出具報(bào)告幾大步驟。多數(shù)臨床標(biāo)本存在大量宿主細(xì)胞和宿主游離核酸，微生物核酸豐度相對較低，有些樣本中人源宿主DNA占比高達(dá)50-90%左右，這會導(dǎo)致后續(xù)測序數(shù)據(jù)中大部分是宿主DNA的信息，而病原微生物的數(shù)據(jù)占比較少，且宿主DNA 的非特異性序列還會干擾下游病原微生物的的判斷。針對這一問題，通常在核酸提取環(huán)節(jié)時(shí)去除宿主DNA或者增加測數(shù)據(jù)量的方式來提高病原微生物的檢出。接下來小編跟大家介紹幾個(gè)去除宿主DNA的小妙招~
目前去除宿主DNA的方法主要分為提取DNA前去除和提取DNA后去除。提取DNA前去除包括物理法、生物法、化學(xué)法，而提取DNA后去除主要通過抗甲基化DNA磁珠來實(shí)現(xiàn)。
1.物理法
該方法基于宿主細(xì)胞和微生物細(xì)胞大小的差異去除宿主細(xì)胞，例如粘膜上皮細(xì)胞平均大小為50 μm，而一些典型的細(xì)菌細(xì)胞一般是1 μm。這種情況下可以采用過濾法去除宿主細(xì)胞，或者根據(jù)細(xì)胞沉降系數(shù)的差別，利用離心法去除宿主細(xì)胞。但是該種方法無法有效去除胞外DNA。
2.生物法
基于微生物和動物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的不同，選擇性的裂解宿主細(xì)胞，利用核酸酶酶解掉釋放出來的宿主DNA，后利用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后純化微生物DNA。或者也可以利用人源細(xì)胞的細(xì)胞膜較微生物外壁脆弱的特點(diǎn)，在核酸提取前用溫和去污劑（如皂苷）裂解宿主細(xì)胞釋放 DNA，再用DNaseⅠ酶解裸露的宿主DNA ，后續(xù)進(jìn)行微生物DNA提取等操作。該種方法通常可使微生物富集效率提高1000倍[1]。
3.化學(xué)法
PMA（疊氮碘化丙錠）是一種可以高效結(jié)合dsDNA的染料，二者結(jié)合后熒光會增強(qiáng)，在可見光的誘導(dǎo)下，PMA分子的疊氮化物基團(tuán)被光解并發(fā)生C-H插入反應(yīng)并與DNA形成共價(jià)鍵，從而產(chǎn)生恒久性的DNA修飾，從而使DNA的片段化。由于這種染料無法通過功能完整的細(xì)胞膜，所以其可以標(biāo)記裸露在外的DNA。該種方法先利用低滲溶液破壞人源宿主細(xì)胞，后利用PMA去除宿主DNA，后結(jié)合用珠磨、PK蛋白酶等方式裂解微生物，最后提取微生物DNA[2]。
4.抗甲基化DNA磁珠
在原核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在腺嘌呤堿基（A）上，在真核生物中，DNA甲基化主要發(fā)生在胞嘧啶堿基（C）上，人類基因中有90%以上的CpG位點(diǎn)被甲基化修飾。該方法先提取全部的DNA，利用帶有蛋白A修飾的磁珠，通過MBD2-Fc蛋白媒介，與宿主DNA中甲基化的CpG位點(diǎn)特異結(jié)合，可有效去除高達(dá)98%的甲基化宿主DNA，從而針對性的去除真核生物中常見的甲基化的核苷酸序列，可實(shí)現(xiàn)3~5倍富集[3]。
如果某些微生物甲基化模式和宿主類似，在去除宿主DNA時(shí)也會被去除。
【參考文獻(xiàn)】
[1] Charalampous T, Kay GL, Richardson H, et al. Nanopore metagenomics enables rapid clinical diagnosis of bacterial lower respiratory infection[J]. Nat Biotechnol, 2019, 37(7): 783‐792. DOI:10.1038/s41587‐019‐0156‐5.
[2] Marotz CA, Sanders JG, Zuniga C, et al. Improving saliva shotgun metagenomics by chemical host DNA depletion [J]. Microbiome, 2018, 6(1): 42. DOI: 10.1186/ s40168‐018‐0426‐3.
[3] Miller S, Naccache SN, Samayoa E, et al. Laboratory validation of a clinical metagenomic sequencing assay for pathogen detection in cerebrospinal fluid[J]. Genome Res, 2019, 29(5): 831‐842.DOI:10.1101/gr.238170.118.
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